为了编好这部著作，李时珍走访了河南、江西、江苏、安激等很多地方。每到一处，他就虚心地向药农和其他劳动人民请教，采集药物标本，收集民间验方。很多人都热情地帮助他，有的人甚至把祖传秘方也交给了他。就这样，李时珍得到了很多书本上所没有的知识，还得到了很多药物标本和民间验方。

李时珍了解药物，并不满足于走马看花式的调查，而是一一采视，对着实物进行比较核对。这样弄清了不少似是而非、含混不清的药物。用他的话来说，就是“一一采视，颇得其真”，“罗列诸品，反复谛视”

李时珍从三十五岁起，动手编写。他化了二十七年工夫，参考了八百多种书籍，经过三次大规模的修改，终于写成了一部新的药物学巨著《本草纲目》。这时，李时珍已经是六十一岁的老人了。

李时珍生前没有能看到《本草纲目》的出版。到1596年《本草纲目》在南京刊行时，李时珍已去世三年了。

《本草纲目》出版后，传到国外，受到各国学者的重视，先后被译成日、英、法、德、俄、拉丁等多种文字。西方称这部书为“东方医学巨典”，给予高度的评价。

李时珍除了写作《本草纲目》外，还著有《濒湖脉学》、《奇经八脉考》、《食物本草》等，也流传很广。另外，他还著有《脉学考证》、《五脏图论》、《白花蛇传》和《所馆诗话》等，可惜现在已经失传了。